| | | 單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項技術，其原理是對分離的單個細胞的微量全基因組DNA進行擴增，獲得高覆蓋率的完整的基因組后進行高通量測序，廣泛應用于癌癥研究、胚胎發(fā)育、輔助生殖、細胞分化、免疫機制、微生物等方向的研究。
獲得高覆蓋度高保真性的全基因組擴增產(chǎn)物是準確全面的測序結(jié)果的保障。為了保證基因組高覆蓋度無偏好性的擴增，在單細胞測序技術誕生的近二十年時間里，全基因組擴增技術經(jīng)歷了幾次重大的變革，WGA主要有三種方式：DOP-PCR，MDA，MALBAC。下面小編就來為大家介紹一下WGA技術的演變歷程，以及怎樣根據(jù)實驗目的選擇相應的擴增方式。 |
 | DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide–Primed Polymerase Chain Reaction) |  |
技術原理：簡并寡核苷酸引物PCR，引物的3' 含6bp的隨機序列，可以隨機的和基因組DNA結(jié)合，從而實現(xiàn)對全基因組的擴增[1]。 應用范圍：因為PCR的指數(shù)擴增特性，放大了基因組上不同序列之間的差異，因而導致擴增出的基因組覆蓋度較低。盡管如此，在1M bin size的水平上，DOP-PCR適合對染色體的CNV進行定量。
商品化試劑盒：Sigma-Aldrich, GenomePlex Single Cell Whole Genome Amplification Kit。 
圖1 DOP-PCR技術原理[4]
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| MDA (Multiple Displacement Amplification) | |
技術原理：2001年由Laskin團隊發(fā)明，使用隨機的六聚體引物和φ29DNA聚合酶進行反應，該聚合酶具有很強的鏈置換特性，能夠在等溫的條件下，擴增產(chǎn)生50~100kb的核酸片段。同時由于其3’-5’核酸外切酶活性和校對活性，φ29 DNA聚合酶具有很高的復制保真性[2]。
應用范圍：MDA法比DOP-PCR擁有更高的基因組覆蓋度，φ29 DNA聚合酶的高效率及高保真性，使得MDA法在對SNV的分析，以及構建大片段文庫上有著顯著優(yōu)勢。但是，和DOP-PCR相同，MDA法依然是指數(shù)擴增，因此依然存在PCR反應的序列偏好性，然而，和DOP-PCR不同的是，這種偏好性并不能重復，因此MDA法不適合進行CNV的分析。 商品化試劑盒：Qiagen, REPLI-g Single Cell Kit。 
圖2 MDA技術原理[4]
| MALBAC (Multiple Annealing and Looping–Based Amplification Cycles) | |
技術原理：2012年由謝曉亮團隊發(fā)明，擬線性的擴增過程降低了指數(shù)擴增的序列偏好性。擴增引物的5’含有27bp的共同序列，3’是8bp的隨機序列，可以和模板在15~20℃的低溫下結(jié)合，經(jīng)過8~12個循環(huán)的擬線性擴增后，再對這些環(huán)狀的擴增子進行指數(shù)擴增[3]。
應用范圍：MALBAC法的優(yōu)勢在于，雖然它依然存在一定的序列偏好性，但和MDA不同，MALBAC的這種偏好性在不同的細胞之間是可重復的，因此可以通過對參考細胞標準化后，進行CNV的分析；另外，由于其擴增的均一性，MALBAC法擴增的等位基因敲除率更低。MALBAC的弱點在于，它使用的聚合酶保真性不如φ29，因此MALBAC在檢測SNV時將會出現(xiàn)更多的假陽性；另外，由于它可重復性的序列偏好性，基因組上低擴增的區(qū)域有時會在擴增過程中丟失。 商品化試劑盒：Yikon, Single Cell Whole Genome Amplification Kit. 
圖3 MALBAC技術原理[4]
由上述的分析可見，MDA和MALBAC各有優(yōu)劣，實際上在不同的文獻中，研究者也會根據(jù)研究目的的不同，采取不同的方式對基因組進行擴增，以滿足研究的需要[5-7] | picoplex特殊隨機引物起始的熱循環(huán)擴增 | |
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 picoplex技術相比于以往的PCR、MDA、MALBAC為基礎的單細胞全基因組擴增技術，操作簡便，擴增重復性良好。特別設計的隨機引物（參加US patent 8，206，913）能減少引物二聚體的形成，從而提高引物和模板的配對效率。 
[1] Telenius H, Carter NP, Bebb CE, et al. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer[J]. Genomics, 1992,13(3): 718-725.
[2] Dean FB, Nelson JR, Giesler TL, et al. Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification[J]. Genome Research, 2001, 11(6): 1095-1099.
[3] Zong C, Lu S, Chapman AR, et al. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell[J]. Science, 2012, 338(6114): 1622-1626.
[4] Lei H, Fei M, Chapman A, et al. Single-cell whole-genome amplification and sequencing: methodology and applications[J]. Annual Review of Genomics & Human Genetics, 2015, 16(1).
[5] Wang Y, Waters J, Leung ML, et al. Clonal evolution in breast cancer revealed by single nucleus genome sequencing[J]. Nature, 2014, 512(7513): 155-160.
[6] Ni X, Zhuo M, Su Z, et al. Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients[J]. PNAS, 2013, 110(52): 21083-21088.
[7] Gawad C, Koh W, Quake S R. Single-cell genome sequencing: current state of the scienc.[J]. Nature Reviews Genetics, 2016.
華雅思創(chuàng)Rubicon授權代理，正品現(xiàn)貨，產(chǎn)品信息如下： PicoPLEX® WGA Kit：用于單細胞文庫構建的全基因組擴增解決方案 PicoPLEX® DNA-seq Kit：單細胞 DNA 文庫制備技術，適用于 Illumina 所有 NGS 測序平臺 ThurPLEX® DNA-seq Kit：更高的通量, 更好的性能, 用于所有 Illumina 的 NGS 平臺 品牌/生產(chǎn)廠家 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品名稱 單位
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